随着对生物芯片技术的看好,有很多个不同的名词来描述它。一般称之为微矩阵(Microarray)或“生物芯片(BioChip)”,虽然“基因芯片(gene chip)”这个词也常用,但是GeneChip是美国Affymetrix公司已注册的基因分析研究用的微矩阵的专利商标名。
一般地,生物芯片可分为DNA芯片,蛋白芯片和Lab-on-chip。DNA芯片和蛋白芯片的承载体一般是固体基片,最常用的是经化学或生物学方法处理的玻璃片。所固定的靶标是DNA(cDNA或人工合成的寡核苷酸)或者是蛋白质。这两种芯片技术中的检测样本的提取、分离、标记、杂交和信号检测是在不同的技术平台上进行的,而Lab-on-chip则是合成了所有的这些步骤在一个技术平台上进行,实现了对样品处理、提纯、反应、检测、分析的整合、微型化、自动化。生物芯片技术也可以分成两部分:硬件(技术平台)和软件(检测的对象和分析方法)。
目前最成熟的、应用最多的是DNA芯片,蛋白芯片的进展势头非常看好但距大规模的应用仍有一定距离,而Lab-on-chip离实用阶段则更远一些,但是它在临床上的应用前景是最值得关注的。有关的评估可以从国际上芯片应用研究的成果进行检索就可以得到。在这里主要对DNA芯片进行分析,以此来分析和展望蛋白芯片及Lab-on-chip的发展前景和可能对人们生活的影响。
DNA微矩阵是一种高通量的技术,它满足了基因组计划实施后人们进行基因功能研究的要求,可以从mRNA水平上来了解基因的功能,这是联系DNA和蛋白质研究的重要一环。通过标记的cDNAs(从样本中抽提出的mRNA反转录得到)与固定在基片上的靶标进行杂交,然后通过芯片扫描仪来扫描检测分析杂交情况,最后通过芯片数据分析软件分析基因表达情况。根据固定的靶标(cDNA或寡聚核苷片段)不同,可以用来检测分析基因的表达水平和特定DNA片段的单核苷多态性(SNPs)。这是DNA微矩阵检测的两个主要对象。其具体的技术过程如下:
1)矩阵的构建。芯片上的靶标可以是cDNAs(部分或完整的),基因组DNAs,或者是化学合成的寡核苷酸序列。
2)探针的准备。从样本中抽提出mRNA,反转录成荧光标记的cDNA;或者是特定的DNA片段以用于检测SNPs。
3)探针与矩阵的杂交。来自两个样本的探针混合在一起,与芯片上的互补序列进行。就如传统的核酸杂交,杂交条件经过优化使得背景最小。未结合上的探针在扫描前被冲洗掉。
4)扫描和检测。用激光共聚焦的扫描仪来扫描杂交后的矩阵,每种荧光染料需要特定波长的激光去激发它。荧光信息存储在电脑中,并进行分析和图象建设。
5)标准化和数据分析。对每一种染料扫描后的图象通过一定的软件处理并合并得到每个点的重叠图,并通过对照点来帮助校正两种荧光染料的标记差异和检测效率。最后用数据分析方法进行数据挖掘,主要是通过数据模型来处理。
通过DNA微矩阵技术相对简单地使研究工作者来检测特定时空条件下的生物体的所有基因的表达成为可能。虽然人们认识到自己能表达的所有基因数只有30000个,但是它们的信息量仍是非常巨大的。通过微矩阵技术将产生大量的信息,从这些信息中将可以提取到很多非常有价值的材料。基于这些材料之上,科学工作者可以提出相关的设想和实验设计,并通过其他的实验来证明它。微矩阵技术正如“基因信息海”中的一张“网”,智者将会网到“鱼”。
目前,DNA芯片应用于科研领域取得了引人瞩目的研究成果。这些研究主要集中在基于DNA微矩阵得到的基因表达谱从中筛选出肿瘤的分型检测的生物标记,相关的研究成果都发表在国际一流杂志上,如本年度6月5日的《PNAS》Heping Zhang等的研究结果表明可以通过他们所创立的数学模型分析芯片数据,从表达谱数据中可以抽提出2-3个基因作为癌症分型的生物标记;9月25日《PNAS》 Mike West等,其研究结果表明可以通过雌激素受体水平和淋巴结情况来区分乳腺癌的情况。本年度8月《Nature 》Saravavn M. Dhanasekaran等的研究结果表明可以通过hepsin 和pim-1两个基因的表达情况来区分前列腺癌。2001年10月25日的《Nature》杂志发表了一篇通过微矩阵技术筛选到抗生素耐药基因的文章;10月26日《Science》杂志发表了Q. Huang等的研究结果,通过微矩阵技术筛选了与人免疫反应有关的基因。这些工作为药物的研发和疾病的诊断治疗提供了坚实的基础,他们的结果表现出了一些可实际应用的迹象,经过一到两年的时间,即可为产业服务和应用到临床上。
实际上,DNA微矩阵就是一个技术平台,它的最大特点是高通量、微型化和数据处理的自动化。随着DNA微矩阵技术的发展,芯片的标准化、样本取得、处理和芯片杂交后的数据分析将成为人们关注的焦点。特别是芯片处理后的数据分析将决定谁可以从基因表达的海量信息中“网”到“鱼”。基因组测序工作产生了巨大的基因序列数据库,有关基因表达谱的研究,也将产生“transcriptomics”和相应的数据库,这是基因功能组研究的起始。
微矩阵技术正在研究领域发挥着它自己应有的潜力并持续地发展,也昭示着蛋白芯片和Lab-on-chip的未来。无疑,后两者在实际应用上将会体现的更直接。蛋白芯片与药物的研发更接近,也贴近疾病的临床检测和诊断。“核酸+蛋白”的检测将为病人提供更确切的治疗方案。不过蛋白芯片的研发技术难度将超过DNA芯片。Lab-on-chip更是预示着一种美好的未来,其核心在于它的制造工艺上,如何来实现它对样品处理到检测分析的整合,如何来大幅度提高检测的灵敏度和降低使用成本,这是它实现在临床应用的最关键的因素。作为DNA芯片和蛋白质芯片其发展的动力主要是对芯片杂交后数据处理所获得的结果,而Lab-on-chip的大幅度发展将来自于它的制造工艺。
可以分析出DNA芯片的最大应用领域是在科研(包括药物开发),而不是人们所关注的临床。美国主要的基因芯片公司Affymetrix与多家制药公司合作,如deCODE,GlaxoSmithKline,Millennium等,研究开发基因芯片技术在药物研发上的应用。DNA微矩阵从技术特点而言,并不适合在临床的应用,因为:
1)DNA芯片所需的样本量很大。按一般芯片试剂盒的要求,需要总RNA在20或50微克以上,国内一般要求提供mRNA为1-3微克。这样的量在临床上是完全不可能去做到的,解决的办法就是通过PCR扩增得到足够的标记探针。目前国内有些公司推出的临床检验用芯片实际上是“多个PCR+基于microarray的杂交显色”,而并没有体现DNA芯片的优势和特色,还不如直接用定量荧光PCR方法检测来的方便、快速。
2)检测灵敏度。按照芯片的检测方法,其检测的核酸拷贝数要多于PCR技术。
3)检测对象。就目前而言,核酸检测的对象比较缺乏。目前病原微生物的基因组研究并没有全面的开展,有关的基因序列相比于人的还是很少。而对于内源性疾病的诊断芯片、基因预测芯片、基因分型芯片,需要有疾病的相应的生物标记----特定基因。用于诊断感染性疾病的亚型分型诊断芯片,对亚型的分析还未充分,并且由于目前还没有相应的治疗药物,分型诊断也难以实现其临床价值。耐药性芯片,主要是通过检测特定片段上的某个碱基是否发生了突变,虽然在方法上是比原有的要方便一些,但是实现在临床的应用还有一段时间。由此决定了目前的诊断用DNA芯片的标志意义超过了现实意义。
4)实验成本。而对于这些技术来说,成本永远是一个值得考虑的问题。DNA芯片相对于一般的普通的分子生物学实验的费用是要高的多,如果系统地进行微矩阵实验,一般只有大型制药公司和经费充足的科研院所才能承受。一套商品化的基因芯片分析系统,包括芯片阵列仪、扫描仪、计算机及其软件等,大约价值11万美元;如果购买芯片公司生产的产品则只需扫描仪和计算机及软件,市场价目前为5-6万美元。
芯片的市场价一般为1-2元人民币/点,再加上每张芯片的耗材费用,合计大约在1000美圆左右。按照国际上发表文章,目前所需的数据处理量,需要芯片至少在二三十张或更多。根据目前国内的国家自然科学基金项目资助额度,一般为十到二十万元,大的项目在一百万元左右。所以在国内科研工作中,基因芯片的实际使用量还比较小,也就造成了国内没有什么有关使用基因芯片的研究成果出现的现象。
但是,“淘金者”却没有得到相应的回报,DNA芯片碰到了冷落的态势。DNA芯片的研究没有形成国外那样的大气候,其原因之一是国内更多的是一种芯片概念的炒作。不可否认基因产业的复杂,投资大、周期长、风险高,但是它产生的利润和实际对国家经济的影响面将是非常大的。生物芯片技术所带来的革命性的技术进步,并对人类的命运起到巨大作用,所以其未来的成长空间是巨大的。国外一些非生物技术公司正在加入基因芯片这一领域的发展,特别是摩托罗拉和惠普。